猛戳→ELISA實驗五大常用原理簡介

        ELISA，即酶聯(lián)免疫吸附實驗，其基本原理是將一定濃度的抗原或者抗體通過物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入待檢標(biāo)本，通過酶標(biāo)物顯色的深淺間接反映被檢抗原或者抗體的存在與否或者量的多少。ELISA技術(shù)作為免疫標(biāo)記技術(shù)（包含免疫熒光技術(shù)，免疫放射技術(shù)，免疫酶技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)）中的一種，已廣泛應(yīng)用于科研和臨床實驗中，具有快速，定性或者定量甚至定位的特點。值得注意的是，恒遠所銷售的ELISA試劑盒產(chǎn)品，僅用于科研實驗，不用于任何臨床診斷！下面就為大家一一詳述ELISA實驗五大常用原理簡介。

    

雙抗體夾心法
        雙抗體夾心法，其基本原理是將一定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入無關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點，然后加入待檢標(biāo)本，通過加入檢測抗體，酶標(biāo)記第二抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈正相關(guān)。

    該方法的適用條件是：含有多個抗原表位的大分子物質(zhì)。因為這種檢測方法需要兩種抗體，所以就涉及抗體配對的問題。一般而言，常用的抗體配對方法有一下幾種：包被抗體為單抗，檢測抗體為多抗；包被抗體為單抗，檢測抗體為單抗，但這兩種單抗針對的抗原表位不同；包被抗體為多抗，檢測抗體為多抗，這兩種多抗一般是來源于不同的宿主。

    這種檢測方法在應(yīng)用酶標(biāo)第二抗體時，應(yīng)該注意的一個原則是：第二抗體必須只能針對檢測抗體，而不能針對包被抗體。鑒于酶標(biāo)二抗的局限性，現(xiàn)在一般廠家都引入生物素親和素放大系統(tǒng)，這種系統(tǒng)在提高反應(yīng)靈敏度的同時，應(yīng)用起來也更加方便，我們只需要對檢測抗體進行生物素標(biāo)記，不需要對每一種不同來源的二抗進行酶標(biāo)記，只需對親和素做HRP標(biāo)記就可以省去很多繁瑣的工作。

競爭法
        競爭法一般分為直接競爭法和間接競爭法，這里我們以直接競爭法為例進行原理講解。直接競爭法，其基本原理是：將合適濃度的包被抗體包被于微孔板中，加入無關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點，加入標(biāo)準(zhǔn)品（樣本）和生物素標(biāo)記的抗原物質(zhì)進行競爭結(jié)合，經(jīng)合適的溫度和一定時間的孵育，洗滌后，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素進行反應(yīng)，TMB顯色，微孔板中顏色的深淺與待測物的濃度呈負相關(guān)。
 
    該方法一般用來檢測具有較少表位的小分子物質(zhì)，當(dāng)然，這種方法也可以用來檢測大分子抗原物質(zhì)甚至是抗體。檢測大分子抗原物質(zhì)時，由于空間位阻的影響，使得該檢測方法沒有雙抗體夾心法檢測大分子抗原物質(zhì)靈敏度高。這種方法在檢測抗體時，可能由于兩種競爭的抗體來源不一，導(dǎo)致兩種抗體趨同性不高，就使得檢測結(jié)果的可靠性不高。

間接法
        間接法一般用來檢測抗體。其基本原理是：將一定量的抗原物包被于聚苯乙烯微孔板，加入無關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點后，加入待測樣本，然后加入酶標(biāo)二抗，經(jīng)孵育和洗滌后，加底物顯色。一般而言，在間接法檢測抗體實驗中，由于酶標(biāo)二抗的局限性，一般檢測的抗體為總的IgG。

雙抗原夾心法
        雙抗原夾心法，與雙抗體夾心法類似，基本原理是將已知濃度的抗原固定于聚苯乙烯微孔板表面，對未結(jié)合位點用無關(guān)蛋白載體進行封閉后，加入待檢樣本，然后加入生物素標(biāo)記的抗原和HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，經(jīng)TMB顯色和終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀讀數(shù)之后即可計算待測物濃度。雙抗原夾心法與間接法都可以對抗體進行檢測，但是前者檢測的是針對該抗原的所有種類的抗體，包含IgG, IgM, IgA，IgD, IgE，這是間接法做不到的。

捕獲法
        捕獲法一般用來測定IgM類抗體。其基本原理是：將抗IgM抗體包被于固相微孔板，用無關(guān)蛋白載體對未結(jié)合位點進行封閉后，加入待測樣本，接著加入抗原物質(zhì)，然后加入針對該抗原的經(jīng)生物素標(biāo)記的特異性抗體和HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，經(jīng)TMB底物顯色和終止反應(yīng)后即可計算濃度。由于我們檢測樣本中的IgM含量時，其中同時含有較高濃度的IgG類抗體，在用一般的間接法檢測時，IgG類抗體和IgM類抗體會和固相抗原進行競爭性結(jié)合，由于IgG占據(jù)優(yōu)勢，勢必導(dǎo)致IgM類抗體能夠結(jié)合上去的量相當(dāng)有限，zui終導(dǎo)致的結(jié)果是假陰性。

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