ELISA操作有何難?

    ELISA具有敏感性高、特異性強、操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于各種抗原和抗體的測定，為輔助臨床診斷與生物科研起到了積極的推動作用。但ELISA測定中影響因素較多，操作過程中每個環(huán)節(jié)都會對試驗結果產生影響，出現錯誤的結果。



    試劑的因素

    試劑的選擇：試劑的選擇是保證血液檢測質量的關鍵要素。雖然國家采用批批檢定的形式對ELISA試劑嚴格把關，但不同廠家的試劑在使用效果上仍存在在差異。要選購度相對高、具有“三證”的試劑，不要用無批號的試劑，選用與儀器配套的試劑。更不要使用過期的試劑和混用不同批號的試劑。

    操作中的因素

    加樣：孵育前加樣時間過長，酶試劑加出孔外，使用滴瓶滴加試劑時，滴加的角度不同和擠壓的力度不同，致使滴加的試劑量不準，都可導致試驗結果不準確。
    控制方法：
    ①實驗樣本過多時，可分批次操作，以減少實驗時間延長造成的誤差；
    ②加酶試劑后，用吸水紙吸干孔外試劑；
    ③作定量試驗時，使用加樣器加注試劑，并經常校正其準確性，此外，要做到一份樣本一個移液頭，防止交叉污染。

    溫育：溫育是ELISA測定為關鍵、容易出現問題的步驟。為常見的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2-8℃。目前國內售ELISA試劑盒溫育時間為37℃，30 min-1 h，進口ELISA試劑盒則通常為37℃，1-2 h能有較*的結合。

    溫育時間、溫度的選擇一般根據試劑盒的說明書選擇溫育的時間、溫度。加完樣本和（或）試劑后將微孔板從室溫放入水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃需要一定時間，如果是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就容易造成實際測定中溫育時間不夠，易致弱陽性標本測不出來。
    控制方法：
    ①如有兩種溫度，盡量使用較低的溫育溫度、較長反應時間的條件；
    ②用1個小溫度計放置在板孔反應液中測量觀察。

    “邊緣效應”的排除“邊緣效應”是在使用96孔板的ELISA測定中，外周孔顯色較中心孔深的現象。產生的原因可能是為96孔板周圍孔與中心孔在溫育中的熱力學梯度造成的，因此在溫育時盡量采用水浴。
洗板：ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。采用手工洗板，孔與孔之間液體易交叉，采用半自動洗板機時，洗液量不足導致洗板不*，洗板針堵塞導致抽吸不*，洗板不暢導致清洗效果差。
    控制方法：
    ①手工洗板時，拍板時要垂直，避免交叉污染，用力不能過猛，防止抗原抗體復合物脫離；
    ②洗板機洗板時應經常檢查沖洗頭是否通暢，若被雜物堵塞時可用注射器針頭挑出；
    ③為了洗滌效果好，實驗室可采用機器與人工洗滌相結合的方法，在機器洗滌后再進行人工洗板1-2次，或適當增加洗板的次數，有資料報道洗板7次能達到理想的洗滌效果。

    顯色：市售ELISA試劑盒中，如以四甲基聯苯胺(TMB)為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以鄰苯二胺(OPD)為底物，則試劑盒提供鄰苯二胺片劑或粉劑。顯色反應條件為37℃或室溫反應15-30 min。以鄰苯二胺(OPD)為底物的試劑，要臨用前30 min配制且必須避光。以四甲基聯苯胺(TMB)為底物的試劑則不需避光，但A、B液應盡量避免接觸金屬器械。

    結果判定：讀取結果要在15-30 min內完成，定性測定用肉眼判讀試驗結果時，反應板應水平距離白色背景10-15 cm；定量測定時用酶標儀讀取結果，酶標儀不應置于陽光或強光照射下，需先預熱15-30 min再進行測試。

    綜上所述，盡管ELISA法操作簡單，但可能影響測定結果的因素也較多。故在實際操作的過程中，要加強質量管理，認真避免或減少影響因素，力求結果準確，為疾病的診斷和科研提供可靠的依據。