嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實驗設(shè)計中要求有良好的參照體系，對實驗結(jié)果分析是非常有用。特別是當(dāng)實驗出現(xiàn)問題時，借助參照體系很容易就可以查出問題所在。良好的參照體系通常包括分子量Marker（用來確定蛋白條帶對應(yīng)的分子量大?。?，空白載體對照（如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對照），已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對照；另外還有內(nèi)參。內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對恒定，在檢測蛋白的表達(dá)水平變化時常用它來做參照物。蛋白含量是肯定要測的。首先合適的上樣蛋白，western圖才比較比較美觀。而且對于需要半定量的western，那是肯定要測含量后再做western了。
1.marker呢，就相當(dāng)于一把標(biāo)尺，用于驗證你的目的蛋白的分子量，比如你的marker上有30和35kD的蛋白條帶，而你的目的蛋白是32kD，跑膠以后你如果看到你的目的蛋白條帶在30和35kD之間，就可以初步斷定是你的目的蛋白。
2. 內(nèi)參呢，內(nèi)參也叫看家基因，在組織或細(xì)胞中都會表達(dá)，且表達(dá)量在不同組織或細(xì)胞中幾乎是相同的，一般有β-ACTIN，GAPDH等。其作用有二，1. 是看提取蛋白質(zhì)量的好壞。如果做western的時候，內(nèi)參照蛋白有條帶，而目的蛋白沒有，說明蛋白的提取和轉(zhuǎn)膜等步驟沒有問題，是目的蛋白的抗體質(zhì)量不好或者是稀釋倍數(shù)不對。2. 是比較客觀的說明目的蛋白的表達(dá)情況，消除上樣量等的誤差。不同的標(biāo)本之間由于蛋白提取的量有差別，可能強陽性的表達(dá)跑出來的帶很弱。因此設(shè)立內(nèi)參照，比較不同標(biāo)本之間的表達(dá)情況。
3. 測一下蛋白濃度再上樣，這樣好點。當(dāng)然也看你的實驗室是定性還是定量了，定性的話，我覺得可以不用測濃度；要是準(zhǔn)備定量，還是盡量保證上樣量一致吧。
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