細(xì)胞活性測定方法 細(xì)胞活性測定方法有臺(tái)盼藍(lán)染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素?fù)饺敕ā?MTT法等。其中MTT法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。但MTT法形成的Formazan 為水不溶性的，需要加有機(jī)溶劑溶解，由于在去上清操作時(shí)會(huì)有可能帶走小部分的Formazan，故有時(shí)重復(fù)性略差。為了解決這個(gè)問題，研究人員又開發(fā)了很 多種水溶性的四氮唑鹽類：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 現(xiàn)就這三種四氮唑鹽類方法作一個(gè)簡單介紹： 1.MTT法
MTT：化學(xué)名： 3-（4，5- 二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫 氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的 甲 ，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛 用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。 缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲 產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲 的有機(jī)溶劑對(duì) 實(shí)驗(yàn)者也有損害。 2.XTT法
XTT：化學(xué)名：2,3- bis（2-methoxy-4-nitro-5- sulfophenyl）-5-[（phenylamino）carbonyl]
-2H-tetrazolium hydroxide，作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細(xì)胞還原成水溶性的橙黃色甲 產(chǎn)物。當(dāng)XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其所產(chǎn)生的水溶性的甲 產(chǎn)物的吸光度與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。
優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于MTT。
缺點(diǎn)：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。 3.CCK-8法或稱WST-8法CCK-8試劑中含有WST–8：化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽]，它 在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪 *（1-Methoxy PMS）的作用下被細(xì)胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物 （Formazan）。生成的甲 物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。該方法已被 廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及藥敏試驗(yàn)等。 優(yōu)點(diǎn)：1、使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；4、重復(fù)性優(yōu)于 MTT；5、對(duì) 細(xì)胞毒性小；6、為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。 缺點(diǎn):1、與MTT相比，CCK-8和XTT的價(jià)格比較貴。2、CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多 加。 三種方法的比較 | | MTT法 | XTT法 | CCK-8法（WST-8法） | | 甲臜物水溶性 | 難溶性 | 水溶性 | 水溶性 | | 檢測波長 | 490 nm | 450nm | 450nm | | 性狀 | 粉末 | 2瓶溶液 | 1瓶溶液 | | 使用方法 | 配成溶液后使用 | 現(xiàn)配現(xiàn)用 | 毋需預(yù)制 | | 使用有機(jī)溶劑 | DMSO或其它溶劑 | — | — | | 方便性 | + | ++ | +++ | | 檢測速度 | + | ++ | +++ | | 重復(fù)性 | + | ++ | ++ | | 穩(wěn)定性 | ++ | + | ++ | | 工作量 | --- | -- | - | | 對(duì)細(xì)胞毒性 | --- | -- | - | | 對(duì)人體毒性 | --- | - | - | MTT原理、步驟、結(jié)果分析方法及注意事項(xiàng) MTT原理 MTT全稱為3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。 MTT比色法，是一種檢測細(xì)胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點(diǎn)是靈敏度高、經(jīng)濟(jì)。
缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加，也會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響，而且溶解甲的有機(jī)溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)者也有損害。 MTT 溶液的配制方法
通常，此法中的MTT濃度為5mg/ml。因此，可以稱取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液（PBS）或無酚紅的培養(yǎng)基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細(xì)菌，放4℃避光保存即可。在配制和保存的過程中，容器用鋁箔紙包住。實(shí)驗(yàn)的時(shí)候我一般關(guān)閉超凈臺(tái)上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
需要注意的是，MTT法只能用來檢測細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，但不能測定細(xì)胞數(shù)。在用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時(shí)候，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT吸光度在0-0.7范圍內(nèi)。 MTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配，過濾后4℃避光保存兩周內(nèi)有效，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存，避免反復(fù)凍融，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分裝在EP管里，用的時(shí)候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時(shí)就不能再用了。 MTT有致癌性，用的時(shí)候小心，有條件帶那種透明的簿膜手套。配成的MTT需要無菌，MTT對(duì)菌很敏感；往96孔板加時(shí)不避光也沒有關(guān)系，畢竟時(shí)間較短，或者你不放心的時(shí)候可以把操作臺(tái)上的照明燈關(guān)掉。 配制MTT時(shí)用PBS（ph=7.4）溶解。PBS配方：NaCl 8g ＋ KCl 0.2g ＋ Na2HPO4 1.44g ＋ KH2PO4 0.24g調(diào)pH 7.4，定容1L。 普通MTT法實(shí)驗(yàn)步驟：
1：接種細(xì)胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔1000-10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200ul。
2：培養(yǎng)細(xì)胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天（可根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康暮鸵鬀Q定培養(yǎng)時(shí)間）。
3：呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4）20ul。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對(duì)于懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ul DMSO，振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。
4：比色：選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。 藥物MTT法實(shí)驗(yàn)步驟
貼壁細(xì)胞：
1：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度 1000- 10000 孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。
2：5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個(gè)梯度，每孔100ul，設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔。建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況
3：5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。
4：每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。
5：終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。
6：每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。
7：同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。 懸浮細(xì)胞：
1：收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a(bǔ)足的1640（無血清）培養(yǎng)基40ul；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋（儲(chǔ)存液100mg/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1:10-1:20）；③需檢測物10ul；④細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100ml 1640） 2：置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。
3：每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值） 4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測量各孔的吸光值。 5、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜），每組設(shè)定3復(fù)孔。 注意事項(xiàng)：
（1） 選擇適當(dāng)?shù)眉?xì)胞接種濃度。
（2） 避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行試驗(yàn)。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
（3） 設(shè)空白對(duì)照：與試驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照。其他試驗(yàn)步驟保持一致，zui后比色以空白調(diào)零。 （4） MTT實(shí)驗(yàn)吸光度zui后要在0-0.7之間，超出這個(gè)范圍就不是直線關(guān)系。 （5） 用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞做MTT測細(xì)胞活力,應(yīng)該加多少1640培養(yǎng)基,多少MTT和DMSO合適根據(jù)書上說的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要盡量去掉培養(yǎng)液，便于DMSO溶解甲臜顆粒進(jìn)行比色測定。 （6） 一般每孔4000個(gè)細(xì)胞為宜，既細(xì)胞濃度在20000個(gè)/ml，MTT加20ul，作用四小時(shí)后洗掉上清液，注意不要將甲臜洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振蕩10分鐘，然后測吸光值。 |
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