一.實驗目的

用差速離心法分離動、植物細胞線粒體。

二.實驗原理

　　線粒體（mitochondria）是真核細胞*的，司能量轉(zhuǎn)換的重要細胞器。細胞中的能源物質(zhì)——脂肪、糖、部分氨基酸在此進行zui終的氧化，并通過藕聯(lián)磷酸化生成ATP，供給細胞生理活動之需。對線粒體結(jié)構(gòu)與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的。
　　制備線粒體采用組織勻漿懸液介質(zhì)中進行差速離心的方法。在一給定的離心場中（對于所使用的離心機，就是選用一定的轉(zhuǎn)速），球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的粘度。在一均勻懸浮介質(zhì)中離心一定時間內(nèi)，組織勻漿中的各種細胞器及其它內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間，就能夠使這些顆粒按其大小、輕重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。細胞器中zui先沉淀的是細胞核，其次是線粒體，其它更輕的細胞器和大分子可依次在分離。
　　懸浮介質(zhì)通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性，在pH7.2的條件下，亞細胞組分不容易重新聚集，有利于分離。整個操作過程應注意使樣品保持4℃，避免酶失活。
　　線粒體的鑒定用詹納斯綠活染法。詹納斯綠B（Janus green B）是對線粒體專一的活細胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體的細胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色，而細胞質(zhì)中的染料被還原成無色。

三.大鼠肝線粒體的分離

實驗用品

（一）、材料
　　大鼠肝臟

（二）、試劑
1．生理鹽水。
2．1％詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。
3．0．25mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris—鹽酸緩沖液（pH7．4）：
　　0．1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷（Tris） 10ml
　　0．1 mol/L鹽酸 8．4ml
　　加重蒸水到 100ml
　　加蔗糖到0.25 mol/L。蔗糖為密度梯度離心用D（+）蔗糖
4．0．34mol/L蔗糖+0．01 mol/L Tris—鹽酸緩沖液（pH7．4）
5．固定液：甲醇—冰醋酸（9：1）
6．姬姆薩染液：Giemsa粉0．5g，甘油33ml，純甲醇33ml。先往Giemsa粉中加少量甘油在研缽內(nèi)研磨至無顆粒，再將剩余甘油倒入混勻，56℃左右保溫2h令其充分溶解，zui后加甲醇混勻，成為姬姆薩原液，保存于棕色瓶。用時吸出少量用1/15mol/L磷酸鹽緩沖液作10～20倍稀釋。
　　1/15mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6．8）：
　　1/15 mol/L KH2PO4 50ml
　　1/15 mol/L Na2HPO4 50ml

（三）、器材
高速離心機、解剖刀剪、小燒杯、冰浴、漏斗、尼龍織物、玻璃勻漿器。

實驗方法

1．制備大鼠肝細胞勻漿。實驗前大鼠空腹12h，擊頭處死，剖腹取肝，迅速用生理鹽水洗凈血水，用濾紙吸干。稱取肝組織2g，剪碎，用預冷到0～4℃的0．25mol/L緩沖蔗糖溶液洗滌數(shù)次。然后在0～4℃條件下，按每克肝加9ml冷的0．25mol/L緩沖蔗糖溶液將肝組織勻漿化，蔗糖溶液應分數(shù)次添加，勻漿用雙層尼龍織物過濾備用。注意盡可能先充分剪碎肝組織，縮短勻漿時間，整個分離過程不宜過長，以保持組分生理活性。

2．差速離心。先將9ml 0．34mol/L緩沖蔗糖溶液放入離心管，然后沿管壁小心地加入9ml肝勻漿使其覆蓋于上層。用冷凍控溫高速離心機進行差速離心（見圖）。

3．分離物鑒定。
（1） 細胞核；取細胞核沉淀一滴涂片，用甲醇—冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆薩染液（原液10～20倍稀釋）染色10min。自來水沖洗，吹干，鏡檢。結(jié)果：細胞核紫紅色，上面附著的少量胞質(zhì)為淺藍色碎片。

（2） 線粒體；取線粒體沉淀涂片（注意勿太濃密），不待干即滴加1％詹納斯綠B染液染20min，覆上蓋玻片，鏡檢。線粒體藍綠色，呈小棒狀或啞鈴狀。

實驗注意事項

　　如果使用不帶冷凍控溫的普通高速離心機操作，應盡量縮短操作時間、注意樣品的冷凍，保持其生理活性。

作業(yè)與思考題

作 業(yè)
　　將線粒體沉淀作一涂片，用姬姆薩染色，檢查是否混雜細胞核和胞質(zhì)碎片，估計分離所得線粒體的純度。根據(jù)你的實際體會，寫出操作注意事項及改進方法。

思 考 題
1．分離介質(zhì)0．25mol/L及0．34mol/L緩沖蔗糖溶液哪一種在下層?有什么作用?
2．分離出的線粒體立即用詹納斯綠B染色和放置室溫2h后再染色，比較二者著色的差異。

四.玉米線粒體的分離

實驗用品

（一）、材料
玉米黃化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）。

（二）、試劑
1．分離介質(zhì)；
　　0.25 mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris—鹽酸緩沖液（pH7．4），3 mmo/L EDTA，0．75mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。
50mmol/L的Tris—Hcl緩沖液（pH7．4）配法：
　　 50ml 0．1 mol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶液與42ml 0．1 mol/L鹽酸混勻后，加水稀釋至100ml。
2．保存液：0．3mol/L甘露醇（pH7．4）
3．20％次氯酸鈉（NaClO）溶液。
4．1％詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。

（三）、器材
溫箱、冰箱、紗布、瓷研缽、冷凍控溫高速離心機。

實驗方法

　　從植物細胞分離線粒體，除了作線粒體功能測定外，在植物細胞遺傳工程中，常用于分離核外基因—線粒體DNA等目的。
　　分離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中的差速離心。介質(zhì)中0．25 mol/L蔗糖也可以用 0．3mol/L甘露醇代替。EDTA整合二價陽離子，Ca2＋除去后細胞間粘著解體，促使組織分散成單個細胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在細胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用。

1．玉米種子用20％次氯酸鈉溶液浸泡10min消毒，清水沖洗30min，再浸泡清水15h。將種子平鋪在放有濕紗布的盤內(nèi)，保持濕度，置溫箱28℃于暗處培肓2～3d。待芽長到1～2cm長時剪下約15g，放0～4℃1h。
2．加3倍體積分離介質(zhì)，在瓷研缽內(nèi)快速研磨成勻漿。
3，用多層紗布過濾，濾液經(jīng)700×g離心10min。除去核和雜質(zhì)沉淀。
4，取上清液10 000×g離心10min，沉淀為線粒體。再同上離心洗滌一次。
5．沉淀為線粒體，可存于0．3mol/L甘露醇中。注意以上勻漿化及離心均控制在0～4℃進行。

實驗結(jié)果

　　線粒體的觀察：取線粒體沉淀涂在清潔的載玻片上，不待干立即滴加1％詹納斯綠B染色20min，放上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍綠色圓形顆粒。